通过这份Western Blot常见问题指南，我们将帮助您直观地识别蛋白印迹上的特定或常见问题，例如背景高、信号弱或无信号，有杂带，染色不均匀等，并提出可能的原因以及一些解决方案 。
蛋白质凝胶电泳蛋白条带分辨率低，泳道有纵向条纹且不直样品过粘，样品泳道边缘有纵向条纹，哑铃型条带，泳道变宽蛋白质聚集导致形状诡异的狭窄泳道泳道宽度不一致，泳道变宽泳道边缘有阴影化学发光免疫印迹非特异性或弥散条带高背景信号微弱或无信号荧光免疫印迹非特异性或弥散条带信号微弱或无信号背景问题（高、不均匀或有斑点）蛋白质凝胶电泳常见问题蛋白条带分辨率低，泳道有纵向条纹且不直可能原因解决方案泳道的蛋白上样量过高减少蛋白上样量。为了获得理想的分辨率，在 10、12、15 或 17 孔的小型胶中，建议的最大样品上样量为每条带 0.5 μg，或者每泳道约 10-15 μg 细胞裂解物。（回到顶部）
样品过粘，样品泳道边缘有纵向条纹，哑铃型条带，泳道变宽可能原因解决方案样品中盐离子浓度过高（硫酸铵）进行透析以降低盐浓度。推荐使用微量透析工具，例如 Thermo Scientific Slide-A-Lyzer MINI 透析装置，0.5 mL 。电泳前，将样品浓缩并重新溶解于低盐缓冲液中。使用小体积的浓缩管，如 Thermo Scientific Pierce PES 蛋白浓缩管，0.5 mL。确保样品中的盐浓度不超过 100 mM。（回到顶部）
蛋白质聚集导致形状诡异的狭窄泳道可能原因解决方案DNA 污染——细胞裂解液中的基因组 DNA 可能导致样品变粘，导致蛋白质聚集，从而影响蛋白质迁移模式和分辨率上样前先去除基因组 DNA 以降低粘度。（回到顶部）
泳道宽度不一致，泳道变宽可能原因解决方案样品中盐离子浓度过高（氯化钠）。高盐浓度会导致电导率增加，从而影响蛋白质迁移，并可能导致蛋白质条带扩散到包含正常盐浓度样品的相邻泳道中进行透析以降低盐浓度。推荐使用微量透析工具，例如 Slide-A-Lyzer MINI 透析装置，0.5 mL。电泳前，将样品浓缩并重新溶解于低盐缓冲液中。使用小体积的浓缩管，如 Pierce PES 蛋白浓缩管，0.5 mL。确保样品中盐浓度不超过 100 mM。凝胶电泳中去垢剂浓度过高（例如 SDS 或 Triton X-100）。去垢剂与凝胶中的阴离子去垢剂 SDS 形成混合胶团，并向下迁移到凝胶中；它们会干扰 SDS-蛋白质的结合平衡大多数非离子型去垢剂（例如 Triton X-100、NP-40 和 Tween 20）会干扰 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。保持 SDS 与非离子型去垢剂的比例在 10：1 或更大，以最小化这些影响。使用去垢剂去除柱或 Thermo Scientific Pierce SDS-PAGE 样品前处理试剂盒去除多余的去垢剂。高浓度的 RIPA 缓冲液会导致泳道变宽并在电泳过程中出现明显的条纹电泳前稀释样品，以降低裂解缓冲液的终浓度，防止缓冲液带来的不利影响。（回到顶部）
泳道边缘有阴影可能原因解决方案裂解液或样品缓冲液中的还原剂过多SDS-PAGE中，还原剂 DTT（二硫苏糖醇）和 TCEP（三（2-羧基乙基）膦）的终浓度应小于 50 mM， β-ME（β-巯基乙醇）还原剂的终浓度应小于 2.5％。（回到顶部）
化学发光免疫印迹常见问题非特异性或弥散条带可能原因解决方案抗体浓度过高降低抗体浓度，特别是一抗的浓度。凝胶上样量过高减少凝胶上加入的样品量。化学发光底物的信号太强减少印迹的成像或曝光时间。更换特异性更好的抗体。缩短膜与底物的孵育时间。孵育结束后，完全去除底物。降低抗体浓度，特别是 HRP 或 AP 标记二抗的浓度。（回到顶部）
高背景可能原因解决方案抗体浓度过高，导致抗体非特异性结合降低一抗或二抗的浓度。封闭液选择不当不要在亲和素-生物素系统中使用牛奶进行封闭。牛奶中含有生物素，这会导致背景过高。在检测磷蛋白时，避免使用磷酸盐缓冲液（如 PBS）和含磷蛋白的封闭剂（如牛奶或酪蛋白）。可以使用含BSA的 Tris 缓冲液封闭。通过封闭一张干净的膜，与抗体孵育后用底物进行检测，来测试封闭液中的交叉反应性。使用碱性磷酸酶（AP）标记物时，应选择 Tris 缓冲体系（TBS）的封闭液，因为磷酸盐缓冲液（PBS）会干扰 AP 的活性。尝试另一种封闭缓冲液。使用我们的封闭液选择指南，为您的实验查找最适合的封闭液。非特异性位点的不充分封闭增加封闭液中的蛋白浓度。优化封闭时间和温度。在室温（RT）下封闭至少 1 小时，或在 4°C 下封闭过夜。在封闭液中添加 Tween 20 去垢剂有助于减少背景。但是，过多的去垢剂会干扰抗体结合。通常， 0.05% 的终浓度比较合适。为便于使用，可选择已包含 0.05％ Tween 20 去垢剂的封闭液，例如 Thermo Scientific StartingBlock T20 封闭液（TBS）或（PBS）或 SuperBlock T20 封闭液（TBS）或（PBS）。使用包含 0.05％ Tween 20 去垢剂的封闭液稀释抗体。使用 Thermo Scientific SuperSignal 蛋白印迹增强剂以降低背景并增强对低丰度和弱免疫反应性抗原的检测。漂洗不充分增加漂洗次数和漂洗缓冲液的体积。将 Tween 20 去垢剂添加到漂洗缓冲液中，终浓度为 0.05％。如果 Tween 20 去垢剂的浓度过高，它会从膜上剥离蛋白质。印迹膜处理不当根据制造商的说明书润湿并活化膜。处理膜时，请始终戴上干净的手套并使用镊子。始终用液体覆盖膜以防止干燥。在所有孵育过程中都要进行震荡。小心处理膜——损坏膜会引起非特异性结合。设备或材料被污染在使用之前制备新鲜的缓冲液并过滤。只能使用干净且无污染的电泳设备、印迹设备和培养皿。化学发光底物的信号太强减少印迹的成像或曝光时间。换用灵敏度更低的底物。缩短膜与底物的孵育时间。孵育结束后，完全去除底物。降低抗体浓度，特别是 HRP 和 AP 标记二抗的浓度。（回到顶部）
信号微弱或无信号可能原因解决方案转印不完全或不理想转印后，通过使用总蛋白染料对凝胶染色以评估转印效率。转印后，使用 Thermo Scientific Pierce 可逆蛋白染色试剂盒（PVDF）或（硝酸纤维素膜）将膜染色，以评估转印效率。 使用气泡滚轮除去转印三明治中的气泡，确保转印过程中凝胶与膜之间充分接触。确保转印三明治以正确的方向放置在转印设备中，使蛋白质迁移到膜上。
根据制造商的说明书润湿并活化膜。使用阳性对照（例如预染蛋白分子量标准）帮助评估转移效率。使用可通过化学发光底物成像的分子量标准，例如Invitrogen iBright 预染蛋白 Ladder或者Invitrogen MagicMark XP Western蛋白Ladder，作为阳性对照。增加转印时间或电压。确保样品前处理条件没有破坏样品的抗原性。（某些蛋白质不能在还原条件下电泳）。与膜的结合不充分对于低分子量抗原，可在转印缓冲液中添加 20％ 甲醇以促进结合并防止蛋白质穿过膜。减少转印时间。低分子量抗原可能会穿过膜。对于高分子量抗原，向转印缓冲液中添加 0.01–0.05% SDS 以促进蛋白从凝胶转移到膜上。更换膜的类型（NC 与 PVDF）。换为孔径较小的膜。抗体浓度过低增加抗体浓度。抗体对靶蛋白的亲和力可能很差。抗体可能失去活性。进行斑点印迹（dot blot）以确定抗体活性。抗原不足在凝胶上加入